دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر

دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی

گروه زیست شناسی دریا

پایان نامه دکتری رشته زیست شناسی دریا گرایش جانوران دریایی

 شناسایی و طراحی  آغازگرهای نشانگر ریزماهواره در ماهی راشگوی معمولی(Eleutheronema tetradactylum, Shaw,1804) خلیج فارس

 

 

کلید واژه: ماهی راشگوی معمولی، Eleutheronema tetradactylum، خلیج فارس، شناسایی، جداسازی، میکروستلایت
چکیده:

تنوع زیستی بخش حساسی از سرمایه طبیعی است. بسیاری از احتیاجات ما از این سرمایه تامین می‌شود. تنوع زیستی نوعی بیمه طبیعت در مقابل حوادث بد و ناگوار است. اهمیت شناخت کامل ماهیان جهت  بهره برداری بهینه از این ذخایر بر هیچ شخص آگاه از مسائل شیلات پوشیده نیست. امروزه با فن آوری های مولکولی می توان تفاوت بین نژاد ها، ژنوتیپ ها یا افراد را در تحقیقات ژنتیک جمعیت با دقت مورد بررسی قرار داد. شناسایی، حفاظت و استفاده پایدار از تنوع ژنتیکی برای موفقیت هر برنامه به نژادی و یا زیست فن آوری امری ضروری است. ریزماهواره ها در DNA هسته تمام یوکاریوت ها و حتی برخی پروکاریوت ها یافت شده است. ریزماهواره ها کوتاه ترین ترتیبات متوالی (۱ تا ۶ جفت بازی) می باشند که تعداد واحد تکرارشونده در هر محل از چند باز تا حدود۳۰ باز متفاوت است. یکی از مشکلات عمده ریزماهواره ها ضرورت ایجاد و غربال کتابخانه  ژنی DNA برای نواحی ریزماهواره ها می باشد. این امر نیازمند شناخت توالی های DNA موجود مورد مطالعه می باشد، که بسیار زمان بر و پر هزینه است.

ماهی راشگوی معمولی (Eleutheronema tetradactylum) از دیر باز مورد توجه ویژه ساحل نشینان و در گروه ماهیان ممتاز منطقه خلیج فارس و دریای عمان قرار دارد. این گونه بعد از حلوا سفید  Pampus argenteus  بالاترین قیمت در میان آبزیان حوزه خلیج فارس را به خود اختصاص داده است. در این تحقیق تعداد ۷۹ نمونه از استان های خوزستان (چوئبده آبادان، بندر ماهشهر و بندر هندیجان) و بوشهر (بندر جلالی بوشهر و بندر دیر) با استفاده از قایق های صیادی مجهز به تورگوشگیر برداشت شد.

اندازه قطعات تعیین توالی شده ۹۸۴- ۶۶۲ جفت باز بود. تعداد شش جایگاه آللی ریزماهواره جهت بررسی مورد بررسی قرار گرفت. پنج جایگاه از نوع کامل(خالص) و یک جایگاه از نوع مرکب بود. ۳ جفت آنها چندشکلی (پلی مورف) و ۳ جفت آنها تک شکلی (مونومورف) بودند. بیشترین تعداد آلل مشاهده شده در جایگاه Eletet2(AB697177) و مربوط به نمونه های استان بوشهر (۵ آلل) و کمترین مقدار آن در جایگاه Eletet16.0(AB697180) و مربوط به نمونه های استان خوزستان (۱ آلل) می باشد.

فهرست مطالب

صفحه   عنوان
    فصل اول: مقدمه و کلیات
     
1   1-1- مقدمه
۵   1-1-1- اهداف و فرضیه های تحقیق
۶   1-2- کلیات
۷   1-2-1- ویژگی های ماهی راشگوی معمولی
۷   1-2-1-1- طبقه بندی
۷   1-2-1-2- اسامی متداول
۸   1-2-1-3- ریخت شناسی گونه
۱۰   1-2-1-4- تغذیه ماهی راشگوی معمولی
۱۰   1-2-1-5- تولیدمثل ماهی راشگوی معمولی
۱۰   1-2-1-6- محل زندگی و گستردگی جغرافیایی ماهی راشگوی معمولی
۱۱   1-2-1-7- وضعیت صید ماهی راشگوی معمولی
۱۲   1-2-1-8- مشخصات عمومی خلیج فارس
۱۳   1-3- تنوع ژنتیکی و اهمیت آن
۱۵   1-3-1- نشانگر چیست؟
۱۶   1-3-1-1- انواع نشانگر
۱۶   1-3-1-2- نشانگرهای ژنتیکی
۱۸   1-3-1-3- نشانگرهای ریخت شناسی
۱۸   1-3-1-4- نشانگرهای فیزیولوژیکی
۱۸   1-3-1-5- نشانگرهای سیتولوژیکی
۱۸   1-3-1-6- نشانگرهای مولکولی
۱۹   1-3-1-6-1- نشانگرهای پروتئینی
۲۰   1-3-1-6-2- نشانگرهای DNA
21   1-3-1-7- ریزماهواره ها
۲۲   1-3-1-7-1- انواع ریزماهواره ها
۲۳   1-3-1-7-2- جداسازی ریزماهواره ها
۲۴   1-3-1-7-3- تکامل ریزماهواره ها
۲۵   1-3-1-7-4- تشخیص آلل های ریزماهواره ای
۲۵   1-3-1-7- 5- چندشکلی ریزماهواره ها
۲۶   1-3-1-7-6- مزایای ریزماهواره ها
۲۶   1-3-1-7-7- مشکلات کار با ریزماهواره ها
۲۹   1-3-1-8- استراتژی نمونه گیری
۳۰   1-3-1-8-1- اندازه نمونه ی مورد نیاز در مطالعات ریزماهواره ای
۳۲   1-3-1-9- کاربردهای ریزماهواره ها
۳۲   1-3-1-9-1- تعیین هویت، آزمون انساب و آنالیز خویشاوندی
۳۳   1-3-1-9-2- نقشه یابی ژنومی
۳۳   1-3-1-9-3- تعیین میزان همخونی
۳۴   1-3-1-9-4- مطالعات مربوط به حفاظت از گونه ها و ژنتیک جمعیت
۳۵   1-3-1-10- تشخیص آلل های ریزماهواره ای
۳۷   1-3-1-11- ناقل
۳۷   1-3-1-11-1- پلاسمید
۳۹   1-3-1-11-1-1- پلاسمید pTZ
39   1-3-1-12- الحاق قطعات به درون ناقل ها
۴۰   1-3-1-13- فسفاتاز قلیایی
۴۰   1-3-1-14- ایجاد DNA نوترکیب
۴۰   1-3-1-15- دگرگونی
۴۲   1-3-1-16- غربال کردن ژنتیکی
۴۲   1-3-1-17- تعیین توالی DNA
     
     
    فصل دوم : مروری بر پیشینه تحقیق
     
45   2-1- مطاعات انجام شده در داخل کشور
۴۵   2-2- مطالعات انجام شده در خارج کشور
     
     
    فصل سوم : مواد و روش های تحقیق
     
۴۹   3-1- روش های مورد استفاده در این تحقیق
۴۹   3-1-1- نمونه برداری
۵۰   3-1-2- استخراج DNA از باله دمی ماهی با استفاده از CTAB
50   3-1-3- ارزیابی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده
۵۰   3-1-3-1- روش اسپکتروفتومتری
۵۱   3-1-3-2- روش الکتروفورزی
۵۱   3-1-3-2-1- بررسی الکتروفورزی کیفیت DNA استخراج شده
۵۱   3-1-4- هضم DNA الگو
۵۲   3-1-5- هضم پلاسمید pTZ57R/T
53   3-1-6- دی فسفریلاسیون DNA هدف با ناقل
۵۳   3-1-7- احیایDNA  الگو هضم شده از روی ژل آگارز
۵۴   3-1-8- تهیه محلول ذخیره سازی باکتری TG1
54   3-1-9- آماده سازی سلول های پذیرا
۵۵   3-1-10- آماده سازی محیط کشت باکتری( LB مایع و جامد)
۵۶   3-1-11- خالص سازی پلاسمید دی فسفریله شده
۵۷   3-1-12- الحاق DNA الگو به ناقل
۵۷   3-1-13- انتقال پلاسمید نوترکیب به سلول پذیرا
۵۸   3-1-14- بررسی سریع پلاسمید های نوترکیب
۵۹   3-1-15- تخلیص پلاسمید به روش لیز قلیایی
۶۰   3-1-16- تعیین توالی نوکلئوتیدی
۶۰   3-1-17- طراحی و مشخصات آغازگرها
۶۰   3-1-18- واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR
61   3-1-19- بررسی محصولات PCR بر روی ژل اگارز
۶۱   3-1-20- ثبت تصاویر
     
     
    فصل چهارم: نتایج
     
63   4-1- نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده
۶۳   4-1-1- روش الکتروفورزی
۶۳   4-1-2- طیف سنجی DNA
64   4-2- نتایج حاصل از برش آنزیمی پلاسمید
۶۴   4-3- نتایج حاصل از برش آنزیمی DNA ژنومی
۶۵   4-4- نتایج حاصل از خالص سازی پلاسمید
۶۶   4-5- احیای قطعات کوچک از روی ژل آگارز
۶۷   4-6- نتایج حاصل از فسفریله کردن پلاسمید
۶۷   4-7- نتایج حاصل از فسفریله کردن قطعات برش یافتهDNA   ژنومی
۶۸   4-8- نتایج حاصل از الحاق پلاسمید به قطعات DNA ژنومی
۶۹   4-9- نتایج حاصل از الحاق پلاسمید و قطعات DNA ژنومی به باکتری TG1
69   4-10- نتایج حاصل از جداسازی پلاسمید و قطعات DNA ژنومی از باکتری
۷۰   4-11- نتایج حاصل از تعیین توالی پلاسمید و قطعات DNA ژنومی تکثیر یافته در باکتری
۷۲   4-12- نتایج حاصل از طراحی آغازگر از توالی های بدست آمده
۷۳   4-13- نتایج حاصل از PCR
78   4-14- آللهای پلی مورف (چند شکل)
۷۹   4-15- تعداد آلل واقعی  ( Na)و موثر Ne ) )
79   4-16- آزمون آغازگرهای چندشکلی ماهی راشگوی معمولی با نمونه های ماهی راشگوی شش خط Polynemus sextarius
     
     
    فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
     
84   5-1- شناسایی و جداسازی آغازگرها ی ریزماهواره
۸۸   5-2- آلل های چندشکل و اختصاصی
۸۹   5-3- آزمون آغازگرها در جمعیت ماهی راشگوی شش خط
۸۹   5-4- نتیجه گیری نهایی
۹۰   5-5- پیشنهادات
     
91   منابع و مآخذ
۹۸   پیوست ها
     
     

 

فهرست اشکال

صفحه   عنوان
۹   شکل ۱-۱- ماهی راشگوی معمولی
۹۸   شکل ۱-۲- ماهی راشگوی معمولی
۱۱   شکل ۱-۳- پراکنش ماهی راشگوی معمولی در جهان
۱۲   شکل ۱-۴- وضعیت صید ده ساله ماهی راشگوی معمولی در ایران
۱۳   شکل ۱-۵- هرم تنوع زیستی در سه سطح ژن، گونه و اکوسیستم
۱۷   شکل ۱-۶- مقایسه نشانگرهای مختلف از نظر هزینه، امکانات مورد نیاز، مقدار اطلاعات  …
۳۵   شکل ۱-۷- شمایی از تنوع ریزماهواره ایی که بوسیله آغازگرها یا بوسیله یک کاوشگر  …
۳۹   شکل ۱-۸- کروموزوم و پلاسمیدها در باکتری
۴۹   شکل ۳-۱- وضعیت صیدگاه های ماهی راشگوی معمولی در این تحقیق
۶۳   شکل۴-۱- نمونه‌ای ازDNA استخراج شده به روش CTAB روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۶۴   شکل۴-۲- پلاسمید هضم شده با آنزیم BamHI روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۶۵   شکل۴-۳- DNA ژنومی هضم شده با آنزیم BamHI روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۶۶   شکل۴-۴- پلاسمید خالص سازی شده با کیت روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۶۷   شکل۴-۵- قطعاتDNA ژنومی برش یافته با آنزیم از روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۶۸   شکل۴-۶- قطعات برش یافتهDNA   ژنومی فسفریله شده روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۶۸   شکل۴-۷- الحاق پلاسمید با قطعات برش یافتهDNA   ژنومی روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۶۹   شکل۴-۸- الحاق DNA   نوترکیب به باکتری TG1 روی ژل آگاروز۷/۰ درصد
۷۰   شکل۴-۹- جداسازی DNA  نوترکیب تکثیر شده از باکتری TG1 روی ژل آگاروز
۷۱   شکل۴-۱۰- تعیین توالی نمونه Eletet 1-1  و توالی های ریزماهواره های شناسایی شده
۷۱   شکل۴-۱۱- تعیین توالی نمونه Eletet 2  و توالی های ریزماهواره های شناسایی شده
۷۱   شکل۴-۱۲- تعیین توالی نمونه Eletet 10   و توالی های ریزماهواره های شناسایی شده
۷۲   شکل۴-۱۳- تعیین توالی نمونه Eletet 16   و توالی های ریزماهواره های شناسایی شده
۷۲   شکل۴-۱۴- تعیین توالی نمونه Eletet 17   و توالی های ریزماهواره های شناسایی شده
۷۴   شکل۴-۱۵- الگوی محصول PCR و باندهای منومورف DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet1-1   و Eletet1-2
75   شکل ۴-۱۶- الگوی محصول PCR و باندهای DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet 2  متعلق به ۱۳ نمونه در مناطق نمونه برداری استان خوزستان
۷۵   شکل ۴-۱۷- الگوی محصول PCR و باندهای DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet 2  متعلق به ۱۵ نمونه در مناطق نمونه برداری استان  بوشهر
 

76

 

   

شکل۴-۱۸- الگوی محصول PCR و باندهای منومورف DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet10

76   شکل ۴-۱۹- الگوی محصول PCR و باندهای DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet16.O متعلق به ۱۳ نمونه در مناطق نمونه برداری استان خوزستان
۷۷   شکل ۴-۲۰- الگوی محصول PCR و باندهای DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet16.O متعلق به ۱۵ نمونه در مناطق نمونه برداری استان بوشهر
۷۷   شکل ۴-۲۱- الگوی محصول PCR و باندهای DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet17 متعلق به ۱۵ نمونه در مناطق نمونه برداری استان های بوشهر
۷۸   شکل ۴-۲۲- الگوی محصول PCR و باندهای DNA ماهی راشگوی معمولی با استفاده از آغازگر Eletet17 متعلق به ۱۳نمونه در مناطق نمونه برداری استان خوزستان
۸۰   شکل ۴-۲۳- الگوی محصول PCR و باندهای DNA ماهی راشگوی شش خط با استفاده از آغازگر Eletet2,16.0,17 متعلق به ۵ نمونه در مناطق نمونه برداری استان بوشهر
     

 

 

 

فهرست جداول

صفحه   عنوان  
۳۶   جدول ۱-۱- مقایسه خصوصیات چند نشانگر DNA
38   جدول ۱-۲- اندازه تقریبی بعضی از پلاسمیدها و منشاء آنها
۴۹   جدول ۳-۱- تعداد و پراکنش نمونه های جمع آوری شده ماهی راشگوی معمولی
۵۲   جدول ۳-۲- ترکیب مواد در محیط هضم آنزیمی DNA الگو
۵۲   جدول ۳-۳- ترکیب مواد در محیط هضم آنزیمی پلاسمید
۵۳   جدول ۳-۴- ترکیب مواد در محیط فسفاتاز قلیایی
۵۷   جدول ۳-۵- ترکیب و حجم مواد در واکنش الحاق
۶۱   جدول ۳-۶-  ترکیب و میزان مواد در واکنش PCR
73   جدول ۴-۱- توالی و مشخصات جفت آغازگرهای مورد استفاده در هر جایگاه
۷۸   جدول ۴-۲- خصوصیات و نتایج بدست آمده از جایگاه های چندشکلی(پلی مورف)
۷۹   جدول۴ -۳- تعداد آلل واقعی وموثر سه جایگاه  بررسی شده در ماهی راشگوی معمولی
۸۸   جدول ۵-۱- متغیرهای جمعیت در مطالعات صورت گرفته برای ماهی راشگوی معمولی
     
     
     
     
93   جدول ۴- ۱۰- ماتریس فواصل ژنتیکی و شباهت ژنتیکی (Nei,1972)