جداسازی و شناسایی اکتینومیست‌های تولید کننده‌ ترکیبات ضدمیکروبی از رسوبات بستر دریای مازندران

دانشکده علوم پایه

گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی

پایان نامه دوره‌ کارشناسی ارشد در رشته میکرو­بیولوژی

موضوع:

جداسازی و شناسایی اکتینومیست‌های تولید کننده‌ ترکیبات ضدمیکروبی از رسوبات بستر دریای مازندران

 

 

چکیده

اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است. هدف از این تحقیق جداسازی اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال از رسوبات بستر دریای مازندران و بررسی پتانسیل تولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسط این ارگانیسم‌ها می‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق ۵ و ۱۰ متر جمع‌آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسط روش‌های مورفولوژی و میکروسکوپی کلنی‌ها، شناسایی و جداسازی شدند. غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسی فعالیت این عصاره خام علیه باکتری‌ها و قارچ‌های بیماریزا و باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک با استفاده از روش انتشار در دیسک بررسی شد. از رسوبات دریا، تعداد ۸۰ جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه ۷ جدایه دارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±۱٫۴) و (۱۸±۱.۴) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (۱۴±۱٫۴) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن ۱۶S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ها نشان داد که ۷ جدایه فعال متعلق به جنسsp. Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با  خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد.

کلمات کلیدی: اکتینومیست‌های دریایی، فعالیت ضد میکروبی، دریای مازندران

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                                         صفحه

            ۱- مقدمه.. ۲

۱-۱- تاریخچه آنتی بیوتیک   ۲

۱-۱-۱- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها.. ۵

۱-۱-۲- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک.. ۷

۱-۱-۳- عوامل موثر بر تولید آنتی بیوتیک.. ۷

۱-۱-۴- ویژگی‌های یک آنتی‌بیوتیک.. ۸

۱-۲-نیاز به کشف ترکیبات فعال زیستی.. ۸

۱-۲-۱- کشف ترکیبات فعال زیستی.. ۹

۱-۲-۲- محدودیت های کشف ترکیبات فعال از طبیعت.. ۹

۱-۳- روش‌های نوین کشف دارو   ۱۰

۱-۳-۱- منابع برای داروهای جدید.. ۱۰

۱-۳-۲-  روند کنونی کشف دارو.. ۱۰

۱-۳-۳- مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها و نیاز به داروهای جدید.. ۱۱

۱-۳-۴-  استفاده توام از آنتی‌بیوتیک‌ها. ۱۴

۱-۴-  علت انتخاب میکروارگانیسم‌ها برای کشف ترکیبات فعال زیستی   ۱۴

۱-۵- اکتینومیست‌ها   ۱۴

۱-۵-۱-  ویژگی‌ اکتینومیست‌ها. ۱۵

۱-۵-۲-  مورفولوژی اکتینومیست‌ها.. ۱۶

۱-۵-۳-  فیزیولوژی اکتینومیست‌ها.. ۱۷

۱-۵-۴- اکولوژی اکتینومیست‌ها.. ۱۸

۱-۵- ۵- طبقه بندی اکتینومیست‌ها.. ۱۹

۱-۵-۶- متابولیت‌های ثانویه.. ۲۰

۱-۵- ۷- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال.. ۲۱

۱-۵-۸- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست. ۲۳

۱-۵-۸-  اهمیت استرپتومیسس‌ها.. ۲۴

۱-۵-۹-  اکتینومیست‌های دریایی.. ۲۵

۱-۵-۱۰-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی.. ۲۷

۱-۵- ۱۱- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید.. ۲۸

۱-۶- اهداف پژوهش   ۲۹

۲- مواد و روش‌ها:.. ۳۲

۲-۱- دستگاه‌ها و تجهیزات   ۳۲

۲-۲- محلول‎ها و مواد مورد نیاز   ۳۳

۲-۳- جمع‌آوری نمونه   ۳۶

۲-۴- غنی‌سازی و کشت اکتینومیست‌ها  ۳۷

۲-۵- جداسازی و تهیه کشت خالص اکتینومیست‌ها  ۳۸

۲-۶- حفظ و نگهداری ذخایر کشت باکتریایی   ۳۸

۲-۶-۱- نگهداری کوتاه‌مدت.. ۳۸

۲-۶-۲- روش نگهداری بلند مدت.. ۳۸

۲-۷- شناسایی باکتری‌ها  ۳۹

۲-۷-۱- بررسی مورفولوژی. ۳۹

۲-۷-۲- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم.. ۳۹

۲-۷-۳-تولید پیگمان محلول   ۴۰

۲-۸-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی  ۴۰

۲-۹- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست   ۴۱

۲-۱۰-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی   ۴۱

۲-۱۰-۱-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال.. ۴۱

۲-۱۰-۲-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال.. ۴۲

۲-۱۰-۳-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک.. ۴۳

۲-۱۰-۴- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین. ۴۳

۲-۱۲-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال   ۴۴

۲-۱۳- استخراج  نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر   ۴۴

۲-۱۴- الکتروفورز با ژل آگارز ۸/۰ درصد   ۴۵

۲-۱۵- تکثیر ژن rDNA 16S  ۴۶

۲-۱۵-۱- برنامه PCR برای ژن‌های ۱۶S rDNA:.. 46

2-16- تخلیص محصول PCR   ۴۷

۲-۱۷- بررسی مولکولی ژن ۱۶S rDNA   ۴۷

۲-۱۷-۱- تعیین توالی ژن ۱۶S rDNA:.. 47

2-17-2- انجام BLAST. 48

2-17-3- رسم درخت فیلوژنی ژن ۱۶S rDNA.. 48

3- نتایج.. ۵۰

۳-۱- جداسازی اکتینومیست‌ها   ۵۰

۳-۲- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال   ۵۲

۳-۳- غربالگری ثانویه جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا   ۵۵

۳-۴- بررسی فعالیت ضد قارچی جدایه‌های فعال   ۵۶

۳-۵- فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک   ۵۸

۳-۶- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)   ۵۹

۳-۷- فعالیت آنزیمی جدایه‌ها   ۶۱

۳-۸- مورفولوژی اسپور کلنی و رنگ آمیزی جدایه‌ها   ۶۱

۳-۹-تولید پیگمان محلول   ۶۵

۳-۱۰- استخراج نوکلئیک اسید و آنالیز آن با الکتروفورز  ۶۶

۳-۱۱- تکثیر ژن ۱۶s rDNA جدایه‌های فعال   ۶۷

۳-۱۱-۱- شناسایی مولکولی جدایه‌ها و رسم درخت فیلوژنی ژن ۱۶S rDNA.. 68

4- بحث و پیشنهادات. ۷۳

۴-۱- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی   ۷۵

۴-۲- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال   ۷۵

۴-۳- استخراج متابولیت‌ها   ۷۶

۴-۴-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال   ۷۶

۴-۵- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین  ۷۷

۴-۶- مورفولوژی کلنی‌ها   ۷۸

۴-۷- بررسی توالی‌ ۱۶S rDNA   ۷۹

۴-۸- جمع بندی   ۷۹

۴-۹-پیشنهادات   ۸۱

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست اشکال

 

شکل ۱-۱٫ متابولیت‌های اولیه و ثانویه و زمان تشکیل این ترکیبات در نمودار رشد باکتری‌ها.. ۲۰

شکل ۲- ۱- خط کش ژنی یک kb. 35

شکل۳- ۱٫ درصد فراوانی جدایه‌های اکتینومیست جداشده از نمونه‌ رسوبات بستر دریا بر حسب عمق آب. ۵۱

شکل ۳-۲ سویه MN2 جداشده از رسوبات بستر دریای مازندران.. ۵۱

شکل۳-۳٫ درصد فراوانی جدایه‌های فعال  علیه باکتری‌های بیماریزا در غربالگری اولیه. ۵۴

شکل۳- ۴٫ غربالگری اولیه با روش cross-streak… 54

شکل ۳-۶٫ فعالیت ضد قارچی عصاره خام استخراج شده از جدایه‌ها… ۵۸

شکل ۳-۷٫ اثر سینرژیسمی عصاره خام سویه MN2 با آنتی بیوتیک تتراسایکلین.   ۵۹

شکل ۳-۸٫ هاله عدم رشد دیسک‌های آغشته به عصاره خام استخراج شده از جدایه‌های فعال علیه MRSA… 60

شکل ۳-۹ . فعالیت آنزیمی جدایه MN2 … 61

شکل ۳-۱۰ . وضعیت اسپور: تولید اسپور منفرد توسط جدایه MN2 (A)و اسپور زنجیره‌ای توسط جدایه (B).MN3. 63

شکل ۳-۱۱ . شکل انشعابات اسپور: تولید اسپور ساده توسط جدایه MN2 (B)و اسپور منشعب توسط MN38(A)… 63

شکل ۳-۱۲ . ظاهر کلنی‌ اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال MN38. 64

شکل۳-۱۳٫  اکتینومیست رشته‌ای:  شکل سلول‌های سویه  MN2 رنگ‌آمیزی شده.. ۶۴

شکل ۳-۱۴٫ تولید پیگمان محلول رنگی توسط جدایه‌های فعال… ۶۵

شکل ۳-۱۵٫ الکتروفورز نوکلئیک اسید استخراج شده از ۷ سویه فعال اکتینومیست‌های جداشده  بر روی ژل آگاروز. ۶۷

شکل ۳-۱۶٫ الکتروفورز تکثیر ژن  ۱۶SrDNA به کمک ژل آگاروز … ۶۸

شکل ۳-۱۷٫ . دندوگرام توالی ژن ۱۶S rDNA جدایه‌های فعال… ۷۱

 

 

 فهرست جداول

جدول ۱-۱٫ دسته‌بندی دارو‌های ضد میکروبی و نحوه‌ی اثر آن‌ها.. ۷

جدول ۱-۲- . ترکیبات جدید کشف شده از اکتینومیست‌های دریایی.. ۲۹

جدول ۲-۱٫ مشخصات جغرافیایی و عمق محل نمونه‌برداری در دریای مازندران.  ۳۶

جدول ۲-۲- ترکیب محیط‌های کشت… ۳۷

جدول ۳-۱- توالی پرایمرهای PA و PH  برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز.. ۴۶

جدول۳- ۲٫ غربالگری اولیه اکتینومیست‌های جداشده از رسوبات بستر دریا با روش cross-streak… 53

جدول ۳-۳٫ غربالگری ثانویه با استفاده از عصاره خام استخراج شده از جدایه‌های فعال. ۵۶

جدول ۳-۴٫ فعالیت ضد قارچی عصاره خام جدایه‌های اکتینومیست فعال.. ۵۷

جدول ۳-۵٫ فعالیت ضدباکتریایی عصاره خام استخراج شده از جدایه‌ها علیه استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) و استافیلوکوکوس اورئوس جداشده از بیماران به روش دیسک دیفیوژن.. ۶۰

جدول ۳-۶٫ مورفولوژی اسپور و رنگ کلنی‌ جدایه‌ها. ۶۲

جدول ۳-۷٫ نتایج بررسی BLAST توالی جدایه‌ها و شباهت آن‌ها در بانک اطلاعاتی NCBI و EzTaxon. 69