پایان نامه ارشد با عنوان جداسازی و تهیه تک کلون­های القاء کننده پرحساسیتی دیررس (DTH) از لیشمانیا ماژور و ارزیابی آن­ها به صورت invitro و invivo در مقایسه با لیشمانین

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم دارویی

دانشکده فناوری­های نوین

پایان­نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد((M.Sc))

گرایش: علوم سلولی و مولکولی

عنوان:

جداسازی و تهیه تک کلون­های القاء کننده پرحساسیتی دیررس (DTH) از لیشمانیا ماژور و ارزیابی آن­ها به صورت invitro و invivo در مقایسه با لیشمانین

 

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                           صفحه

خلاصه فارسی………………………………… ۱

مقدمه ……………………………………. ۳

فصل اول: کلیات

۱-۱ تعریف بیماری لیشمانیوز………………….. ۶

۱-۱-۲ تاریخچه لیشمانیوز در جهان……………… ۷

۱-۱-۳ تاریخچه لیشمانیوز در ایران…………….. ۸

۱-۲ رده­بندی و طبقه­بندی انگل لیشمانیا…………. ۹

۱-۳ مورفولوژی و سیر تکاملی انگل لیشمانیا……… ۱۱

۱-۳-۱-۱ مورفولوژی انگل……………………… ۱۱

۱-۳-۱-۲ شکل بی تاژک (آماستیگوت یا جسم لیشمن)….. ۱۱

۱-۳-۱-۳ شکل تاژک دار (پروماستیگوت)…………… ۱۲

۱-۳-۲-۱ سیر تکاملی انگل…………………….. ۱۵

۱-۳-۲-۲ سیر تکاملی انگل در بدن حشره………….. ۱۵

۱-۳-۲-۳ پشه خاکی…………………………… ۱۵

۱-۳-۲-۴ سیر تکاملی انگل در بدن میزبان مهره دار… ۱۶

۱-۴  راههای انتقال لیشمانیا به انسان…………. ۱۸

۱-۴-۱ انتقال از طریق نیش پشه خاکی……………. ۱۹

۱-۴-۲  انتقال مکانیکی………………………. ۱۹

۱-۴-۳ انتقال از راه خون…………………….. ۱۹

۱-۴-۴ انتقال مستقیم………………………… ۱۹

۱-۵ بیماری­زایی لیشمانیا…………………….. ۲۰

۱-۵-۱ خصوصیات بیماری لیشمانیا……………….. ۱۹

۱-۵-۲ لیشمانیوز احشایی……………………… ۲۰

۱-۵-۳  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…… 21

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن……… ۲۲

۱-۵-۳-۲  لیشمانیوز جلدی خشک…………………. ۲۲

۱-۵-۳-۳ لیشمانیوز جلدی مرطوب ۲۲

۱-۵-۳-۴ لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas) 23

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………………………. 24

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی………………. ۲۴

۱-۶ ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا……………… ۲۵

۱-۶-۱  مشخصات ایمنولوژیکی در لیشمانیوز پوستی….. ۲۵

۱-۶-۱-۱ نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال………… ۲۵

۱-۶-۱-۲ نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…….. ۲۶

۱-۶-۱-۳ عمل سلولهای نوتروفیل و ماکروفاژ در لیشمانیوز ۲۶

۱-۶-۱-۳  عملکرد T-CELL……………………………………………………. 27

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیکی در لیشمانیوز احشایی…. ۲۸

۱-۶-۲-۱ نقش ایمنی همورال در کالاآزار………….. ۲۸

۱-۶-۲-۳ نقش ایمنی سلولی در کالاآزار…………… ۲۸

۱-۶-۲-۴ .نقش مهم سلول های CD+4……………………………………. 29

1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………. ۳۰

۱-۷-۱ روشهای مستقیم تشخیص انگل………………. ۳۰

۱-۷-۱-۱ . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده……………………………… ۳۱

۱-۷-۱-۱ رنگ آمیزی………………………….. ۳۱

۱-۷-۱-۲ کشت انگل…………………………… ۳۲

۱-۷-۲  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل………. ۳۲

۱-۷-۲-۱ آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال. ۳۲

۱-۷-۲-۲ آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی.. ۳۳

۱-۷-۲-۲-۱ تستهای پوستی……………………… ۳۳

۱-۷-۲-۳ ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH). 34

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……. ۳۵

۱-۷-۳-۱ معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی….. ۳۵

۱-۷-۴ تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T) 37

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

فصل سوم: مواد و روشها

۳-۱کشت انگل……………………………….. ۴۳

۳ -۱-۱  مواد مورد نیاز جهت کشت انگل………….. ۴۳

۳-۱-۲٫ وسایل مورد نیاز جهت کشت انگل………….. ۴۳

۳-۱-۳٫ طرز تهیه محیط کشت مایع RPMI- 1640‌………. ۴۴

۳-۱-۴٫ طرز تهیه محیط کشت کامل……………….. ۴۴

۳-۱-۵٫ طرز تهیه محیط کشت NNN……………………………………… 44

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………… 45

3-1-7. روش کشت انگل………………………… ۴۵

۳-۱-۸٫ روش شمارش سلولها…………………….. ۴۶

۳-۱-۸-۱٫ مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل……… ۴۶

۳-۱-۸-۲٫ شمارش با لام نئوبار…………………. ۴۶

۳-۲٫ جداسازی انگلها با limiting dilution assay…………………… 47

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay…. 48

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay……………………………………… 48

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…….. ۵۰

۳-۳-۱٫ مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……….. ۵۰

۳-۴ تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها………………………….. ۵۲

۳-۵ الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )………………………………… 53

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……… ۵۳

۳-۵-۲ سیستم بافری………………………….. ۵۴

۳-۵-۳  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE….. 54

3-5-4 آماده­سازی نمونه………………………. ۵۷

۳-۵-۶ طرز تهیه بافر الکترود…………………. ۵۷

۳-۵-۷٫ روش انجام SDS-PAGE…………………………………………….. 58

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250……………………. 59

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:……. 59

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay………………. 60

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford…………….. 60

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………… ۶۱

۳-۷ تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)…………………………. 62

3-7-1 روش انجام تست L.T.T……………………………………………….. 63

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T……….. 64

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………. ۶۶

۳-۸-۱ مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی ۶۷

۳-۸-۲  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………. ۶۷

۳-۹ تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH……. 69

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………………………………………………………………………… 69

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی……………….. ۶۹

۳-۹-۳  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………….. 70

فصل چهارم: نتایج

۴-۱ کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution 72

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها. ۷۲

۴-۳ نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford…. 73

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………. 74

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B…………………. 74

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C………………….. 75

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D……………….. 76

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)……………………………… 76

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A…………………… 77

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………… 79

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی.. ۷۹

۴-۵-۱  نتایج تست DTH 24 ساعته……………….. ۷۹

۴-۵-۲ نتایج تست DTH 48 ساعته………………… ۸۲

۴-۵-۳ نتایج تست DTH 72 ساعته………………… ۸۳

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

منابع…………………………………….. ۹۵

خلاصه انگلیسی………………………………. ۱۰۶

فهرست اشکال و جداول و نمودارها

عنوان                                                                                                                           صفحه

شکل ۱-۱٫ اشکال مختلف انگل های لیشمانیا ……… ۱۱

شکل۱-۲٫ پروماستیگوت لیشمانیا (خارج سلولی) …… ۱۴

شکل -۱-۳٫ اشکال اماستیگوت و پروماستیگوت …….. ۱۵

شکل ۱-۴٫ پشه خاکی …………………………. ۱۷

شکل۱-۵٫ چرخه زندگی لیشمانیا در میزبان مهره دار . ۱۸

شکل ۱-۶٫٫ اشکال مختلف لیشمانیوز جلدی (سالک) …. ۲۴

شکل ۱-۷٫ بلعیده شدن پروماستیگوت لیشمانیا توسط یک سلول ماکروفاژی …………………………………………. ۲۸

شکل۳-۱٫ شکل شماتیک لام نئوبار ……………….. ۴۸

جدول۳-۱٫ جدول تهیه  ژل جدا کننده پایین SDS-PAGE 56

جدول۳-۱٫ جدول تهیه  ژل جدا کننده بالا SDS-PAGE ……. 57

جدول۳-۱٫ جدول تنظیم رقت دستگاه spect …………. 62

شکل ۴-۱٫ پروفایل پروتئینی باندهای حاصل از تک­کلون­ها در مقایسه با نمونه لیشمانین استاندارد…………………….. ۷۴

جدول ۴-۱٫ نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنB   ۷۵

جدول ۴-۲٫ نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن c  ۷۶

جدول ۴-۳٫ نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنی D    ۷۷

جدول ۴-۴٫ نتایج حاصل از تست L.T.T در نمونه آنتی­ژنیM 78

جدول ۴-۵٫ مقایسه نتایج اندکس تحریکی به دست آمده در حضور نمونه­های آنتی­ژنی تک کلونی

و Con-A…………………………………………………………………………………. 79

نمودار۱-۴٫ نتایج میانگین اندکس تحریکی هر یک از تک کلون­ها در تست L.T.T………………………………………………………………………………………. 80

جدول۴-۶٫  میانگین تست­های DTH ،۲۴ ساعته………. ۸۱

نمودار ۲-۴٫ بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از ۲۴ ساعت    ۸۱

جدول۴-۷٫  میانگین تست­های DTH ، ۴۸ ساعته ……… ۸۲

نمودار ۴-۳٫ بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از ۴۸ ساعت    ۸۲

جدول۴-۸٫  میانگین تست­های DTH ،۷۲ساعته ………. ۸۳

نمودار ۴-۴٫ بررسی نتایج تست­های داخل پوستی پس از ۷۲ ساعت ۸۳

 

 

 

 

خلاصه فارسی

 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­کلون­های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.