خانه / علوم پایه / زیست / پایان نامه کارشناسی ارشد با عنوان تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

پایان نامه ارشد با عنوان تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری

دانشگاه دامغان

دانشکده زیست شناسی

پایان نامه کارشناسی ارشد

 زیست شناسی (گرایش بافت شناسی و جنین شناسی)

تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

 

چکیده

 

تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

 

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­کنند استفاده شد.

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

کلید واژگان: سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر

 

فهرست مطالب

 

 

عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه.. ۱

مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته.. ۱

۱-۱ سلول­های بنیادی جنینی.. ۳

۱-۲ سلول­های بنیادی بالغ.. ۴

۱-۳ سلول­های بنیادی مغز استخوان.. ۵

۱-۳-۱ مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. ۸

۱-۳-۲ تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی. ۸

۱-۳-۳ پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. ۱۰

۱-۴ کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. ۱۴

۱-۵ انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها   ۱۷

۱-۵-۱ فاکتورهای نوروتروفیک. ۱۷

۱-۵-۱-۱ انواع فاکتور­های نوروتروفیک.. ۱۸

۱-۵-۲ گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. ۲۰

۱-۵-۲-۱ ساختار گیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین.. ۲۰

۱-۵-۲-۲ ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. ۲۲

۱-۶ سلول­های بنیادی عصبی.. ۲۵

۱-۶-۱ نوروسفر.. ۲۵

۱-۶-۱-۱ نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. ۳۱

۱-۷ ضرورت اهداف تحقیق.. ۳۳

فصل دوم: مواد و روش­ها.. ۳۵

۲-۲ تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. ۳۶

۲-۲ جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ.. ۳۶

۲-۲-۱ طرز تهیه محیط کشت    a-MEM.. 36

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد کلسیم و منیزیم (۲/۷ : PH).. 37

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA. 37

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان.. ۳۹

۲-۲-۵ پاساژ سلولی.. ۳۹

۲-۳ تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. ۳۹

۲-۳-۱ ایمونوسیتوشیمی CD71. 40

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید ۴%.. ۴۱

۲-۳-۱-۲ طرز تهیه ژلاتین ۱/۰ درصد.. ۴۱

۲-۳-۱-۳ ساخت سرم بز ۱۰%.. ۴۱

۲-۳-۱-۴ طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (۴/۷ – ۲/۷ = PH).. 42

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. ۴۲

۲-۳-۲ رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز.. ۴۳

۲-۴بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی. ۴۴

 ۲-۵ تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی.. ۴۵

۲-۶ بررسی مولکولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین.. ۴۶

۲-۶-۱ استخراج RNA کل از سلول‌های کشت شده.. ۴۶

۲-۶-۲بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده.. ۴۸

۲-۶-۳ الکتروفورز ژل آگارز.. ۴۹

۲-۶-۴ واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-).. 52

2-6-5 انتخاب پرایمر.. ۵۳

۲-۶-۶ آماده‌سازی پرایمرها. ۵۴

۲-۶-۷ واکنش PCR. 54

2-7 آنالیز آماری.. ۵۸

فصل سوم: نتایج.. ۵۹

۳-۱ مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت   ۵۹

۳-۲ تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز   ۶۰

۳-۳ ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت   ۶۰

۳-۴ تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی.. ۶۰

۳-۵ تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین.. ۶۱

۳-۶ ارزیابی بیان ژن­های فاکتورهای نوروتروفیک و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن .. ۶۱

۴-۱ نتیجه­گیری و بحث .. ۷۰

۴-۱ مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها   ۷۱

۴-۲ بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. ۷۲

۴-۳ پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی.. ۷۴

۴-۴ تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در کشت طولانی مدت   ۷۶

۴-۵ نتیجه گیری.. ۷۷

پیشنهادات.. ۷۷

مراجع.. ۷۹

 

 

 

فهرست شکل­ها

 

شکل ۱-۱٫ مسیرهای پیام رسانی که با واسطه P75NTR  تنظیم می­شود…. ۲۲

شکل ۱-۲٫ نوروتروفین­ها و گیرنده­های مربوط با آن:رسپتور تیروزین کیناز و  P75NTR.   ۲۳

شکل ۱-۳٫ مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم می­شود… ۲۴

شکل ۱-۴٫ سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن…. ۲۵

 شکل ۱-۵ .ارزیابی شکل­گیری نوروسفر.. ۲۶

 شکل ۱٫ تصاویر فاز کنتراست سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی در محیط کشت در پاساژهای مختلف.. ۶۲

 شکل ۲٫ شناسایی سلول­های استرومایی مغز استخوان موش صحرایی.. ۶۳

شکل ۳٫ تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته  .. ۶۴

شکل ۳٫ تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم  MSCs پس از هفته سوم.. ۶۵

شکل۴ تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی     ۶۶

 شکل ۵ تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین  .. ۶۶

شکل۶ A.الگوی بیان ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت)… ۶۷

شکل ۶٫ C الگوی بیان ژن پیش­ساز عصبی و ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت).    ۶۷

 نمودار ۶ A.  مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل… ۶۸

 نمودار۶  B.مقایسه میزان بیان نسبی ژن­های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل..   ۶۹

 

 

فهرست جدول­ها

 

جدول۱-۱ . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی.. ۶

جدول۱-۲ اطلاعات مربوط به پرایمرها، F : پرایمر بالادست ، R : پرایمر پایین‌دست   ۵۷

 

قیمت:   ۱۲۰۰۰ تومان

 

فرمت

مطلب مشابه

دانلود پایان نامه با عنوان سیاست کیفری ناظر بر سلامت حمل ونقل انرژی

عنوان: سیاست کیفری ناظر بر سلامت حمل ونقل انرژی چکیده گسترش روز افزون انشعابات غیرمجاز …