خانه / علوم پایه / جانوری / دانلود پایان نامه با عنوان بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR دربافت کبد موش های نرمال و چاق

دانلود پایان نامه با عنوان بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR دربافت کبد موش های نرمال و چاق

 

بررسی میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی به روش Real time PCR   در بافت کبد موش های نرمال و چاق

 

 

عنوان                                         فهرست مطالب                                           صفحه

چکیده:  ۱

فصل  اول:  کلیات   ۲

۱-۱- بیان مسئله. ۳

۱-۲- اهداف پژوهش. ۴

۱-۳- فرضیات اصلی پژوهش. ۴

۱-۴۱- جنبه جدید بودن و نوآوری در تحقیق. ۴

فصل  دوم:  مروری بر مطالعات گذشته   ۵

۲-۱-آمیلاز  ۶

۲-۱-۱- تاریخچه. ۶

۲-۱-۲- آمیلاز در تکامل انسان. ۶

۲-۱-۳- کارکردهای آمیلاز. ۷

۲-۱-۴- ساختار آمیلاز. ۹

۲-۱-۵- اندازه گیری سطح خونی. ۹

۲-۲- آلفا آمیلاز  ۱۰

۲-۲-۱-کارکرد آلفاآمیلاز. ۱۱

۲-۲-۲- آلفا آمیلاز در فیزیولوژی انسان. ۱۲

۲-۳- آمیلاز بزاقی یا Ptyalin  ۱۲

۲-۳-۱- تنوع ژنتیکی در آمیلاز بزاقی. ۱۲

۲-۴- آلفا آمیلاز پانکراس  ۱۳

۲-۵- آلفا آمیلاز در پاتولوژی  ۱۳

۲-۵-۱- تفسیر میزان آلفا آمیلاز. ۱۳

۲-۶- بافر محدود کننده آلفا آمیلاز  ۱۴

۲-۷- مطالعه فعالیت آنزیم  ۱۴

۲-۷-۱- روشهای اندازه گیری فعالیت آلفاآمیلاز تا قبل از روش رنگ سنجی  ۱۴

۲-۷-۲ – روشهای رنگ سنجی :. ۱۵

۲-۸- معماری دمین های ساختار آلفا آمیلاز (Domain)  ۱۵

۲-۹- ژن های آلفا آمیلاز در انسان  ۱۶

۲-۱۰- آلفا آمیلاز در موش  ۱۸

۲-۱۰-۱-تفاوت توالی انتهای ۵ mRNA های آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی موش از لحاظ اندازه. ۱۹

۲-۱۰-۲- مطالعات مربوط به آنالیز توالی mRAN آلفا آمیلاز کبدی  ۲۰

۲-۱۰-۳- خصوصیات  mRAN آلفا آمیلاز کبدی. ۲۰

۲-۱۱- مهار کننده های آلفا آمیلاز  ۲۱

۲-۱۱-۱- چای سبز. ۲۲

۲-۱۱-۲- فواید چای سبز. ۲۲

۲-۱۱-۲-۱-جلوگیری از بیماری گرفتگی رگها. ۲۳

۲۱۱-۲-۲-تاثیر چای سبز روی افراد مبتلاء به تری گلیسیرید ۲۴

۲۱۱-۲-۳-رقیق شدن خون و جلوگیری از لخته شدن آن ۲۴

۲۱۱-۲-۴-کاهش فشار خون و جلوگیری از ابتلاء به آن ۲۴

۲۱۱-۲-۵-حداقل رساندن میزان صدمات وارد شده به مغز و قلب ۲۵

۲۱۱-۲-۶-حفاظت در مقابل انواع سرطان ۲۵

۲۱۱-۲-۷-جلوگیری از دیابت نوع ۲ ۲۵

۲۱۱-۲-۸-کاهش وزن ۲۶

فصل سوم  مواد و روشها   ۲۷

۳-۱- روش های اجرایی کار :  ۲۸

۳-۱-۱- حیوان آزمایشگاهی مورد مطالعه :. ۲۸

۳-۱-۱-۱-دلایل انتخاب این حیوان به طور خلاصه عبارتند از :. ۲۸

۳-۱-۱-۲-شرایط نگه داری حیوانات :. ۲۸

۳-۱-۲- نوع مطالعه  ۲۹

۳-۲- روش اجرای طرح (چاق کردن موش ها با استفاده از رژیم غذایی با چربی بالا)  ۲۹

۳-۲-۱- تهیه عصاره ی آبی و الکلی چای سبز. ۳۰

۳-۲-۲- جدا سازی کبد و خونگیری از قلب موش. ۳۰

۳-۳- استخراج RNA  ۳۴

۳-۳-۱- وسایل کار استخراج  RNA. 34

3-3-2- مراحل استخراج    RNA.. 34

3-3-2-1-  رسوب دادن RNA :. 35

3-3-2-2-  شستشوی RNA :. 35

3-3-2-3-  خشک کردن رسوب RNA :. 35

3-3-3-  ارزیابی کمی و کیفی RNA استخراج شده:. ۳۶

۳-۳-۳-۱-  اندازه گیری مقدار RNA :. 36

3-3-3-2- بررسی کیفی RNA :. 36

3-3-3-3-  حفظ و نگهداری RNA:. 37

3-4- بررسی بیان ژن  ۳۷

۳-۴-۱-  RT-PCR. 37

3-4-2-  تکثیر cDNA. 39

34-2-1 PCR(Polymerase Chain Reaction) 39

34-2-2- مواد و وسایل مورد نیاز برای ساخت  cDNA 43

34-2-3- روش انجام آزمایش ساخت  cDNA 44

34-2-4- نحوه انجام واکنش RT-PCR   برای اطمینان از صحت سنتز cDNA 45

34-2-5- آشکار سازی محصولات PCR با الکتروفورز ۴۷

۳۴-۲-۶- دستگاههای مورد نیاز برای الکتروفورز ۴۷

۳۴-۲-۷– مواد لازم برای الکتروفورز ۴۷

۳۴-۲-۸- نحوه انجام الکتروفورز ۴۸

۳۴-۲-۹- آشکار سازی ژل ۴۸

۳-۵- Real time PCR. 49

3-5-1- موارد استفاده از Real-time PCR. 49

3-5-2- فازهای مختلف یک واکنش Real time PCR. 50

3-5-3- روش‌های سنجش با Real-time PCR. 51

3-5-3-1- روش غیر اختصاصی سنجش با Real-time PCR 51

3-5-4- مفهوم Threshold وCt. 52

3-5-5- نحوه  رسم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis). 53

3-5-6- نحوه انجام Real time PCR. 55

3-5-6-1- مواد لازم برای انجام  Real time PCR. 55

3-5-6-2-روش انجام آزمایش Real time PCR. 55

3-5-6-3- آنالیز آماری  . ۵۷

۳-۶-اندازه گیری α-Amylase در سرم موش:  ۵۷

۳-۶-۱- جداسازی سرم از خون موش. ۵۷

۳-۶-۲- اندازه گیری α-Amylase در سرم روش فتومتریک. ۵۷

فصل چهارم  نتایج. ۶۰

۴-۱- مشاهدات افزایش وزن موش های گروه تست  ۶۱

۴-۲- تعیین کیفیت و غلظت RNA استخراج شده  ۶۶

۴-۳- بررسی کیفیت cDNA سنتز شده به وسیله PCR  ۶۷

۴-۴-آنالیز منحنی ذوب (Melt Curve Analysis)  ۶۸

۴-۴-۱- مقایسه بیان ژن liver alpha amylase در موش های چاق و نرمال. ۷۰

۴-۴-۲-اثر چای سبز بر بیان ژن liver alpha amylase بر روی موش های چاق  ۷۱

۴-۵- اندازه گیری آلفا آمیلازدر سرم به روش فتومتریک  ۷۲

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری   ۷۳

۵-۱- بحث و نتیجه گیری  ۷۴

۵-۲-پیشنهادات  ۸۱

 

منابع  ۸۳

خلاصه انگلیسی  ۹۲

 

 

عنوان                                       فهرست جداول                                          صفحه

جدول ۳-۱-رژیم غذایی پر چرب  ۲۹

جدول ۳-۲-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA  ۴۴

جدول ۳-۳-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتزcDNA  ۴۴

جدول ۳-۴-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA  ۴۵

جدول ۳-۵-توالی پرایمرها برای تکثیر قطعه مورد نظر دارای ژن آلفا آمیلاز کبدی  ۴۵

جدول ۳-۶ مواد لازم برای انجام واکنش RT PCR  ۴۶

جدول ۳-۷-مواد لازم برای Real time PCR. 55

جدول ۳-۸-پرایمرهای مورد استفاده برای Real time PCR. 56

جدول ۳-۹-مقادیر لازم برای انجام تست سنجش آلفا آمیلاز  ۵۹

جدول ۴-۱-تغییرات وزن موش ها تحت رژیم غذایی متفاوت  ۶۱

جدول ۴-۲-میزان جذب نور توسط DNA  در طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر  ۶۷

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان                                        فهرست نمودارها                                          صفحه

نمودار ۳-۱-فازهای مختلف واکنش تکثیر  ۵۱

نمودار ۳-۲-Cycle threshold&Threshold. 53

نمودار ۳-۳-منحنی ذوب  ۵۴

نمودار ۳-۴-مراحل مختلف انجام واکنش Real time PCR. 56

نمودار ۴-۱-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی  ۶۴

نمودار ۴-۲-تغییرات وزن موش ها کنترل تیمار و کنترل عادی  ۶۴

نمودار ۴-۳-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی  ۶۵

نمودار ۴-۴-تغییرات وزن موش ها چاق تیمار و چاق عادی  ۶۵

نمودار ۴-۵-منحنی تکثیرژن آلفا آمیلاز کبدی  ۶۹

نمودار ۴-۶-منحنی ذوب ژن آلفا آمیلاز کبدی  ۶۹

نمودار ۴-۷-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و کنترل عادی  ۷۰

نمودار ۴-۸-متوسط میزان تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی و چاق کنترل  ۷۱

نمودار ۴-۹-تغییرات آمیلاز در سرم موش های چاق و نرمال بر حسب IU/ml به روش فتومتریک  ۷۲

 

 

 

 

عنوان                                       فهرست اشکال                                         صفحه

شکل۲-۱-نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است  ۱۱

شکل۲-۲-ساختار کریستالی آلفا آمیلاز جو ایزوآنزیم ۱  ۱۶

شکل۲-۳-جایگاه ژن آمیلاز روی ژن ۱p21  ۱۷

شکل۲-۴-این شکل تکامل ژن آمیلاز انسانی را نشان می دهد  ۱۹

شکل۲-۵-توالی ای که بعنوان عامل تفاوت در سایز بین  mRAN آلفا آمیلاز کبدی و غدد بزاقی  ۲۰

شکل۲-۶-مقایسه شماتیکی از mRAN آلفا آمیلاز کبدی و بزاقی  ۲۱

شکل۳-۱-پلت آزمایشگاهی  ۳۰

شکل۳-۲-مراحل خونگیری از قلب موش  ۳۲

شکل۳-۳-مراحل جداسازی کبد موش  ۳۳

شکل۳-۴- غلظت مواد استفاده شده در Master mix استفاده شده در PCR  ۴۶

شکل۳-۵-اتصال SYBR به DNA  ۵۲

شکل۴-۱-تصویر باند حاصل از RNA استخراج شده  ۶۷

شکل۴-۲-صویر محصولات PCR چند نمونه که به صورت تصادفی انتخاب شده بودند  ۶۸

 

 

چکیده:

مقدمه و اهداف

آلفا آمیلاز آنزیمی از راسته هیدرولازها است  که پیوندهای ۱به۴ آلفا گلیکوزیدی در پلی ساکاریدها را کاتالیز می کند و یکی از مهمترین آنزیم های گوارشی است. استفاده از مهارکننده های آلفا آمیلاز (مانند چای سبز) می تواند در کنترل وزن مفید باشد، بنابراین مقایسه میزان بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی بین موش های چاق و نرمال و تاثیر مهار کننده های آنزیم در میزان بیان ژن می تواند به مطالعات درمانی چاقی و  سندرم متابولیک  کمک نماید.

مواد و روش ها

موش ماده NMRI (6 هفته ای) به طور تصادفی به ۴ گروه (۸=n)تقسیم شدند. گروه اول  موش های نرمال بودند که تحت هیچ تیماری قرار نگرفته بودند. گروه دوم  موش های نرمال بودند که عصاره ی آبی الکلی چای سبز (به میزان ۲/۰ میلی گرم) مصرف کرده بودند. گروه سوم موش هایی بودند که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند وگروه چهارم موش هایی بودند که علاوه بر این که رژیم غذایی پر کالری دریافت کرده بودند در این مدت از عصاره ی آبی الکلی چای سبز هم (به میزان ۲/۰ میلی گرم) دریافت کرده بودند. طی  ۸ هفته، در ۴ گروه وزن بدن به صورت هفتگی اندازه گیری شدو پس از پایان دوره بافت کبدی جدا شده و بیان آلفا آمیلاز کبدی اندازه گیری شد. پس ازجداسازی RNA و سنتزcDNA،Real time -PCR با پرایمر اختصاصی برای ژن  Amy-1 ژن انجام شد.

نتایج

متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق عادی در مقایسه با موش های کنترل عادی  افزایش یافته، و این افزایش از لحاظ آماری معنی دار است (P value≤۰٫۰۱).همچنین متوسط تغییرات بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی در موش های چاق تیمار در مقایسه موش های چاق عادی کاهش یافته، واین کاهش هم از لحاظ آماری معنی دار است ( P value≤۰٫۰۴). لذا می توان گفت مصرف هم زمان چای سبز با رژیم غذایی پر کالری اثر کاهنده بر روند افزایش بیان ژن آلفا آمیلاز کبدی دارد.

واژه گان کلیدی : آلفا آمیلاز، کبد، بیان ژن، چاقی،چای سبز

قیمت:   ۱۲۰۰۰ تومان

 

فرمت

مطلب مشابه

دانلود پایان نامه با عنوان تئوری تئوکراسی و قانون اساسی جمهوری اسلامی ایران

  عنوان: تئوری تئوکراسی و قانون اساسی جمهوری اسلامی ایران فهرست مطالب عنوان                                                                                                                          صفحه …