خانه / علوم پایه / جانوری / پایان نامه ارشد با عنوان بررسی بیان برخی miRNA در رده سلولی مشتق از سرطان رتینوبلاستوما بیان کننده افزایشی TGIF2LX در اثر مجاورت با داروی SD-208

پایان نامه کارشناسی ارشد با عنوان بررسی بیان برخی miRNA در رده سلولی مشتق از سرطان رتینوبلاستوما بیان کننده افزایشی TGIF2LX در اثر مجاورت با داروی SD-208

وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی

دانشگاه علوم پزشکی وخدمات بهداشتی درمانی اراک

گزارش طرح تحقیقاتی شماره: ۸۷۲

عنوان:

بررسی بیان برخی miRNA در رده سلولی مشتق از سرطان رتینوبلاستوما بیان کننده افزایشی TGIF2LX در اثر مجاورت با داروی SD-208

 

چکیده

زمینه و هدف: رتینوبلاستوما از تومورهای داخل چشمی شایع در کودکان می باشد. اگرچه در درمان رتینوبلاستوما پیشرفت وجود دارد ولی شکست در درمان و مرگ و میر در کشور های توسعه یافته چشم گیر می باشد. مهمترین علت این شکست مقاومت دارویی و عوارض آن می باشد.هدف این مطالعه ارزیابی اثر متقابل داروی SD-208 داروی ضد سرطان و افزایش بیان TGIF2LX در سلول های Y79 رده سلولی رتینوبلاستوما می باشد.

روش پژوهش: در اولین مرحله ارزیابی پروتئین TGIF2LX ،وکتور PEGFP-N1 که شامل تمام سکانس ژن TGIF2LXبود به سلول های Y79 ترانسفکت شد و بیان آن توسط میکروسکوپ UV و Realtime RT-PCR ثابت شد. همراه با ترانسفکشن سلول با دز های  مختلف داروی SD-208 ( (0,1µM,2µMتیمار شد.سپس الگوی بیان ۵miRNA  شامل Let7g,18a,34a,22,20a در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و بدون تیمار در مقایسه با سلول های ترانسفکت نشده مورد بررسی قرارگرفت.

یافته‌ها:ما متوجه شدیم که تمام miRNA ها در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و با داروی SD-208 افزایش بیان داشتند p<0.05 بجز miRNA20a.

نتیجه گیری:این اولین مطالعه است که نشان داد که SD-208 بیان ژن هموباکس وmiRNA های متفاوت را افزایش می دهد که نقش تومورساپرسوری در رتینوبلاستوما را دارند.همچنین نتایج ما پیشنهاد می کند که استفاده همزمان TGIF2LXو SD-208 می تواند روش جدید در درمان رتینوبلاستوما باشد.

واژگان کلیدی: رتینوبلاستوما، TGIF2LX، miRNA، Y79 Cell line، SD-208

 

فهرست عناوین صفحه

فصل ۱:مقدمه و بیان مسئله ۱

۱‌.۱‌رتینوبلاستوما ۲

۱‌.۱‌.۱‌ اپیدمیولوژی ۲

۱‌.۱‌.۲‌ پاتوژنز ۳

۱‌.۱‌.۳‌ ویژگی های کلینیکی وتشخیصی ۵

۱‌.۲‌ تاریخچه خانوادگی ۵

۱‌.۳‌ تشخیص ۵

۱‌.۴‌ ارزیابی قبل از درمان ۶

۱‌.۵‌ درمان ۶

۱‌.۶‌ مکانیسم مولکولی سرطان ۹

۱‌.۶‌.۱‌ مسیر پیام رسانی TGFβ ۹

۱‌.۶‌.۱‌.۱‌        خانواده لیگاند های TGFβ ۱۱

۱‌.۶‌.۱‌.۲‌        رسپتور نوع ۱و۲ ( TGFβRI,II) 11

1‌.۶‌.۱‌.۳‌        فسفریلاسیون SMAD 12

1‌.۶‌.۲‌ تنظیم پیام رسانی TGFβ ۱۲

۱‌.۶‌.۳‌ دخالت پیام رسانیTGFβ  در سرطان ۱۳

۱‌.۶‌.۴‌ ژنهای همئوباکس(Homeobox) 14

1‌.۶‌.۴‌.۱‌        ساختار ژن های همئوباکس ۱۴

۱‌.۷‌    نقش ژن های همئوباکس (Homeobox) در ایجاد سرطان ۱۷

۱‌.۸‌ miRNA……………………………………. ……………………………………. 18

1‌.۸‌.۱‌ بیوژنز miRNA ها و نحوه مهار ترجمه ۱۹

۱‌.۹‌ miRNA و سرطان ۲۰

۱‌.۱۰‌ miRNA ابزاری برای شناسایی و تشخیص سرطان ۲۱

۱‌.۱۱‌ miRNA ودرمان سرطان ۲۲

۱‌.۱۲‌  بیان مسئله و اهمیت پژوهش ۲۳

۱‌.۱۳‌  اهداف پژوهش ۲۴

۱‌.۱۳‌.۱‌  هدف اصلی ۲۴

۱‌.۱۳‌.۲‌  اهداف ویژه ۲۴

۱‌.۱۳‌.۳‌  هدف کاربردی ۲۵

فصل ۲: بررسی متون ۲۶

۲‌.۱‌ بررسی متون مرتبط با موضوع ۲۷

فصل ۳:مواد و روش ها ۳۲

۳‌.۱‌ مواد شیمیایی و آنزیم ها ۳۳

۳‌.۱‌.۱‌ پلاسمیدوسویه باکتری ۳۵

۳‌.۱‌.۱‌.۱‌        خصوصیات پلاسمید ۳۶

۳‌.۱‌.۱‌.۲‌        خصوصیات میزبان ۳۷

۳‌.۲‌ روش ها ۳۷

۳‌.۲‌.۱‌  کشت باکتری ۳۷

۳‌.۲‌.۱‌.۱‌        مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری ۳۷

۳‌.۲‌.۱‌.۲‌        طرز تهیه محیط کشت LB مایع ۳۸

۳‌.۲‌.۱‌.۳‌        گلیسرول استاک ۳۸

۳‌.۲‌.۲‌ روش انجام   miniprepاستخراج DNA  پلاسمیدی از باکتری ۳۹

۳‌.۲‌.۲‌.۱‌        بررسی کمی وکیفی DNA پلاسمیدی ۴۱

۳‌.۲‌.۳‌ هضم آنزیمی پلاسمید های استخراج شده ۴۵

۳‌.۲‌.۴‌ کشت سلولی ۴۶

۳‌.۲‌.۴‌.۱‌        محیط کشت ۴۶

۳‌.۲‌.۴‌.۲‌        سرم جنینی گاوFBS 47

3‌.۲‌.۴‌.۳‌        تهیه محیط انجاد از سلولها ۴۷

۳‌.۲‌.۴‌.۴‌        خصوصیات سلولهای مورد استفاده شده در این پایان نامه ۴۸

۳‌.۲‌.۵‌ تعیین منحنی کشندگی انتی بیوتیک G418 48

3‌.۲‌.۶‌ منطبق سازی سلولها ۴۸

۳‌.۲‌.۷‌ ترانسفکشن سلولهای Y79  با وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX 49

3‌.۲‌.۸‌ انتخاب سلولهای مثبت ۵۰

۳‌.۲‌.۹‌ بررسی بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده در سطح mRNA بوسیله Realtime RT-PCR……………………………………….           ۵۱

۳‌.۲‌.۹‌.۱‌        محافظت از RNA 52

3‌.۲‌.۹‌.۲‌        استخراج RNA 55

3‌.۲‌.۹‌.۳‌        تیمار نمونه RNA باآنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز  I 59

3‌.۲‌.۹‌.۴‌        سنتز DNA مکمل(cDNA) 60

3‌.۲‌.۹‌.۵‌        PCR(Polymerase chain reaction) واکنش زنجیره ای پلیمراز ۶۴

۳‌.۲‌.۹‌.۶‌        واکنش Realtime PCR 68

3‌.۲‌.۹‌.۷‌        تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش Realtime RT-PCR 77

3‌.۲‌.۱۰‌  بررسی بیان eGFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western blot 78

3‌.۲‌.۱۰‌.۱‌ الکتروفورز عمودی SDS-PAGE 78

3‌.۲‌.۱۰‌.۲‌ رنگ آمیزی SDS-PAGE 84

3‌.۲‌.۱۰‌.۳‌ وسترن بلاتینگ ۸۶

۳‌.۲‌.۱۱‌  بررسی میزان تکثیر سلولی بوسیله تجزیه نمک تترازولیوم ۹۰

۳‌.۲‌.۱۱‌.۱‌ بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل ۹۰

۳‌.۲‌.۱۱‌.۲‌ بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل ۹۱

۳‌.۲‌.۱۱‌.۳‌ پروتکل شمارش سلول ۹۲

۳‌.۲‌.۱۲‌  مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX, miRNA Let7g,18a,34a,22,20  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله Real time RT-PCR 92

فصل ۴: نتایج و یافته ها ۹۶

۴‌.۱‌Mini prep   و هضم DNA  پلاسمیدی جهت تایید وکتور نوترکیب ۹۷

۴‌.۲‌ بررسی بیانTGIF2LX  در سطح mRNA 98

4‌.۲‌.۱‌ نتیجه بررسی کیفی و کمی RNA 98

4‌.۲‌.۲‌ بررسی کیفی cDNA 99

4‌.۳‌ بررسی بیان TGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده ۱۰۱

۴‌.۳‌.۱‌ مطالعه بیان TGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده Y79  در مقایسه با نمونه های کنترل بوسیله میکروسکوپ…………………………..           ۱۰۱

۴‌.۳‌.۲‌ تایید بیان واضح ژن GFP-TGIF2LX توسط Realtime RT- PCR 102

4‌.۳‌.۳‌ مطالعه بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده با وکتور حاوی GFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western Blot 104

4‌.۳‌.۴‌ مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل………………….. ………………….. ۱۰۵

۴‌.۴‌ بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 105

4‌.۴‌.۱‌ نتایج ازمایش (MTT)Microculturetetrazolium Test 105

4‌.۴‌.۲‌ بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل ۱۰۶

۴‌.۵‌ بررسی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20a در سلولهای ترانسفکت شده و کنترل ۱۰۸

۴‌.۶‌ مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل ۱۰۹

۴‌.۷‌ Ct در واکنش Realtime PCR 110

فصل ۵: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادها ۱۱۳

۵‌.۱‌ بحث ۱۱۴

۵‌.۲‌ تاثیر بیان افزایشی TGIF2lX بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 116

5‌.۳‌ تاثیر دارویSD-208  بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 بیان کننده افزایشی TGIF2LX و کنترل ۱۱۷

۵‌.۴‌ اثر SD-208 بر روی بیان TGIF2LX در رده سلولی Y79 ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل………………………………..           ۱۱۸

۵‌.۵‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیانmiRNA های مورد مطالعه ۱۱۸

۵‌.۵‌.۱‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNAlet7g در رده سلولی Y79 118

5‌.۵‌.۲‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA18a در رده سلولی Y79 119

5‌.۵‌.۳‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA34a در رده سلولی Y79 119

5‌.۵‌.۴‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA22 در رده سلولی ۱۱۹

۵‌.۵‌.۵‌  اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA20a در رده سلولی Y79 120

5‌.۶‌ نتیجه گیری ۱۲۰

۷٫۵ پیشنهاد ها …………………………………………………………………………………………………………………۱۲۱

منابع و مراجع ۱۲۲

پیوست ها ۱۳۱

 

فهرست اشکال صفحه

شکل ‏۱‑۱: چشم راست کودک دارای لوکوکوریا (چشم گربه ای) ۲

شکل ‏۱‑۲: مدل ۲ ضربه ای رتینوبلاستوما ۴

شکل ‏۱‑۳: چگونگی فعال شدن گیرنده توسط TGFβ ۱۰

شکل ‏۱‑۴: چگونگی فعال یا مهار شدن مسیر TGFβ ۱۱

شکل ‏۱‑۵: مدل بیوژنز miRNA و نحوه عملکرد آن ۲۰

شکل ‏۳‑۱: شمایی از روش ترانسفکشن ۵۰

شکل ‏۳‑۲: تبدیل DEPC به اتانول و دی اکسید کربن در طی اتوکلاو ۵۵

شکل ‏۳‑۳: نمایش پیام های فلورسنت در ۴۰ چرخه Realtime PCR 69

شکل ‏۳‑۴: ساختار رنگ SG (سایبرگرین) ۷۱

شکل ‏۳‑۵: نمایش جذب رنگ SG(سایبرگرین) که منجر به افزایش پیام فلورسنت در طی واکنش PCR می شود. ۷۱

شکل ‏۳‑۶: نمایش کاربرد منحنی ذوب جهت تشخیص و تمایز محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی واکنش PCR 73

شکل ‏۳‑۷: شکل داروی SD-208 92

شکل ‏۳‑۸: شمای کلی از Realtime RT-PCR جهت miRNA 93

شکل ‏۴‑۱: نتیجه Mini Prep و سپس هضم انزیمی DNA پلاسمیدی استخراج شده ازباکتری حاوی  وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX و pEGFP- N1.. 97

شکل ‏۴‑۲: مورفولوژی سلول های سرطانی  Y79با بزرگنمایی ۱۰ توسط میکروسکوپ نوری ۹۸

شکل ‏۴‑۳: کیفیت RNA  استخراج شده را نشان می دهد که بر روی آگاروز ۲/۱% ران شده است. ۹۹

شکل ‏۴‑۴: محصولات RT- PCR برای ژن GAPDH.برای اطمینان از کیفیت RNAاستخراج شده ازرده  سلولیY79  و Y79-N  و Y79-X  پس از ساختcDNA  با پرایمر های اختصاصی GAPDH 100

شکل ‏۴‑۵: محصولاتRT- PCR  برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز ۲%. ۱۰۱

شکل ‏۴‑۶: مطالعه سلولهای Y79 بعد از ۲۱ روز دوز انتخابی G418 است  که توسط میکروسکوپ نوری (الف)، ) UV ب و ج) را نشان میدهند. بزرگنمایی X10 102

شکل ‏۴‑۷: منحنی ذوب برای پرایمر TGIF2LX و GAPDH 102

شکل ‏۴‑۸: نتایج Realtime RT-PCR 103

شکل ‏۴‑۹: محصولات Realtime RT- PCR  برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز ۲%. ۱۰۳

شکل ‏۴‑۱۰: مطالعه بیان TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله آنتی بادی پلی کلونال بر علیه این پروتیئن ۱۰۴

شکل ‏۴‑۱۱: اثر داروی SD-208 را بر روی بیان TGIF2LX با Realtime RT-PCR 105

شکل ‏۴‑۱۲: نتیجه MTT بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل که به صورت معنی داری درصد Cell Viabillity کاهش یافته بود. p<0.05 106

شکل ‏۴‑۱۳: اثر داروی SD-208 بر روی رده های سلولی  Y79,Y79-N. p>0.05 107

شکل ‏۴‑۱۴: رابطه یcell viability در سلول های Y79وY79-NوY79-X درDMSO,untreate و دز ۱و۲ ماکرومولار SD-208 در  Optimum time(48h) نشان میدهد.P<0.05 108

شکل ‏۴‑۱۵: منحنیmelting peak  مربوط به پرایمر  miRNA U6,18a وNTC 108

شکل ‏۴‑۱۶: تغییرات بیان miRNA  های مورد مطالعه در این پژوهش، در سه رده سلولی Y79, Y79-N1 , Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR 109

شکل ‏۴‑۱۷: تغییرات بیانmiRNA  های مورد مطالعه در این پژوهش را در Optimum dose (µM2) سه رده سلولی Y79, Y79-N1 , Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR 110

 

 

فهرست جداول صفحه

جدول ‏۳‑۱: لیست کلیه مواد مورد نیاز و شرکت های سازنده ۳۳

جدول ‏۳‑۲: فهرست دستگاه ها و وسایل مورد استفاده در این پژوهش ۳۴

جدول ‏۳‑۳: شرایط هضم آنزیمی ۴۵

جدول ‏۳‑۴: اجزاء واکنش سنتز cDNA 63

جدول ‏۳‑۵: توالی و مشخصات پرایمر ها ۶۷

جدول ‏۳‑۶: اجزاء واکنش RT-PCR 67

جدول ‏۳‑۷: برنامه زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنشRT-PCR 68

جدول ‏۳‑۸: مواد لازم به ازای هر واکنش Realtime RT-PCR 76

جدول ‏۳‑۹: برنامه ی زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنش Realtime RT-PCR 76

جدول ‏۳‑۱۰: مرحله افزودن آنزیم PolyA Polymerase 94

جدول ‏۳‑۱۱: مرحله سنتز رشته اول cDNA 94

جدول ‏۳‑۱۲: مرحله تکثیر به روش Realtime PCR 95

جدول ‏۳‑۱۳: دما ومدت زمان جهت Realtime PCR miRNA 95

جدول ‏۴‑۱: غلظت و میزان خلوص اسید نوکلئیک های حاصل از سلول ها ۹۹

جدول ‏۴‑۲:  Ct حاصل از Realtime PCR برای ژنهای   GAPDH , TGIF2LX 111

جدول ‏۴‑۳:  Ct  حاصل از Realtime PCR برای miRNAU6, Let7g, 18a, 34a, 22, 20a 112

 

فهرست پیوست­ها صفحه

پیوست ‌أ : نقشه پلاسمید PEGFP-N1 132

پیوست ‌ب: نقشه پلاسمید PEGFP-TGIF2LX 133

پیوست ‌ج: میزان تغییرات بیان ژن های مورد مطالعه در رده سلولی Y79,Y79-N به همراه standard error و p-Values در سریال دز ۱۳۴

پیوست ‌د: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن TGIF2LX در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 136

پیوست ‌ه: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA Let7g در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 137

پیوست ‌و: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 18a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 138

پیوست ‌ز: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 34a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 139

پیوست ‌ح: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 22 در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 140

پیوست ‌ط: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 20a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values 141

قیمت:   ۱۲۰۰۰ تومان

 

فرمت

مطلب مشابه

دانلود پایان نامه با عنوان تئوری تئوکراسی و قانون اساسی جمهوری اسلامی ایران

  عنوان: تئوری تئوکراسی و قانون اساسی جمهوری اسلامی ایران فهرست مطالب عنوان                                                                                                                          صفحه …