مقایسه  بیان  ژنهای  TTK  ،ARMC3 و TPTE  در نمونه های  بافت بیماران مبتلا به سرطان پستان با  بافت نرمال

دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی – درمانی قزوین

معاونت پژوشی

پایان نامه دوره کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی پزشکی

عنوان

مقایسه  بیان  ژنهای  TTK  ،ARMC3 و TPTE  در نمونه های  بافت بیماران مبتلا به سرطان پستان با  بافت نرمال

 

 

 

چکیده :

مقدمه: سرطان پستان هنوز شایعترین سرطان در بین زنان می باشد. بیومارکرهایی که در بافت سرطانی بیان می شوند نقش مهمی درتشخیص، پیش آگهی و پاسخ به درمان دارند. ژن‌های سرطانی- بیضه‌ایی غالبا در بافت نرمال بیضه بیان می‌شوند ولی بیان برخی از آنها در انواعی از سرطان‌ها نیز گزارش شده است. چون بیضه یک مکان محافظت شونده از سیستم ایمنی می‌باشد، در صورت بیان این ژن‌ها در تومور می توان از آنها به عنوان اهداف‌ مناسبی برای ایمونوتراپی سرطان پستان استفاده کرد.

روش بررسی: پس از اخذ تعداد ۹۵ نمونه شامل۴۰ نمونه توموری، ۴۰ نمونه مجاور تومور و ۱۵ نمونه نرمال نمونه از بانک زیستی، استخراج RNA از آنها انجام گرفت. سپس RNA های استخراج شده  DNase Treatment  شده و از روی آنها cDNA  ساخته شد و با روش Real-Time PCR، بیان ژنهای ARMC3, TPTE,TTK   به همراه ACTB (کنترل داخلی) مورد بررسی قرار گرفت.

نتیجه: ۴۳٫۶% از بافت توموری و ۲۵٫۶%  بافت مجاور تومور رونوشت ARMC3 را بیان کردند.  ARMC3 در ۴۱% از نمونه های تومور افزایش بیان و در ۴۶٫۲%  کاهش بیان داشته است. همچنین بیان این ژن در  ۱۲٫۸% از نمونه های توموری بدون تغییر بود. این تغییرات از لحاظ آماری معنی دار بودند. ۲۱٫۶% از بافت توموری و ۸٫۱%  بافت مجاور تومور رونوشتTPTE را بیان کردند. TPTE در ۳۴٫۱% از نمونه های تومور افزایش بیان و در ۵۸٫۵% کاهش بیان داشته است. همچنین بیان این ژن در۷٫۳%  از نمونه های توموری بدون تغییر بود. این تغییرات در هر سه گروه معنی دار بودند. ۵۰% از بافت توموری و ۲۰%  بافت مجاور تومور رونوشت TTK را بیان کردند. TTK  در ۴۵%  نمونه های تومور افزایش بیان و در ۵۰%  کاهش بیان داشته است. همچنین بیان این ژن در  ۵% از نمونه های توموری بدون تغییر بود که در گروههای افزایش و کاهش بیان معنی دار بودند.  لازم به ذکر است که هیچ نمونه نرمالی ژنهای مورد بررسی را بیان نکرد و نیز تمامی نمونه‌ها ژن ACTB را بیان کردند.

بحث: از انجایی که این ژنها دارای بیان بالاتری در نمونه توموری نسبت به مجاور تومور  بوده و نیز از انجا که در نمونه نرمال هیچ بیانی نداشتند حائز اهمیت می باشند. همچنین بیان برخی از این ژنها در بافت مجاور تومور ممکن است با مرحله سرطانی شدن مرتبط و شاید به این دلیل باشد که این بافتها تحت تاثیر تغییرات انکوژنیک و اپی ژنتیک سرطان پستان قرار می گیرند. با توجه به این نکات شاید بتوان از این ژنها به عنوان کاندیدی جهت مارکر‌های زیستی مناسب برای سرطان پستان در نظر گرفت.

کلمات کلیدی: سرطان پستان، ژن‌های سرطانی- بیضه ایی، مارکر زیستی، ایمونوتراپی

 

فهرست مطالب

فهرست مطالب i

فهرست جداول v

فهرست اشکال vii

فصل اول: مقدمه و اهمیت  موضوع ۱

۱-۱: مقدمه ۲

۱-۲: اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق ۳

۱-۳: اهداف طرح ۴

۱-۳-۱: هدف کلی ۴

۱-۳-۲: اهداف فرعی ۴

۱-۳-۳: اهداف کاربردی ۵

۱-۴: فرضیات ۵

فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده ۶

۲-۱: آناتومی و فیزیولوژی پستان ۶

۲-۱-۱: ساختار و عملکرد پستان ۷

۲-۱-۲: گردش خون پستان ۸

۲-۱-۳: تخلیه لنفاوی پستان ۹

۲-۱-۴: عصب رسانی پستان: ۹

۲-۱-۵: ناهنجاری‌های پستان ۹

۲-۱-۶: بیماری‌های خوش خیم پستان ۹

۲-۲: سرطان پستان ۱۰

۲-۲-۱: شیوع سرطان پستان در جهان و ایران ۱۰

۲-۲-۲: کلیت سرطان پستان ۱۱

۲-۲-۳: سرطان درجا یا غیرتهاجمی ۱۱

۲-۲-۴: سرطان مهاجم پستان ۱۲

۲-۲-۵: علل ایجاد سرطان پستان ۱۴

۲-۲-۶: علائم سرطان پستان ۱۶

۲-۲-۷: تشخیص سرطان پستان ۱۷

۲-۲-۸: رده بندی سرطان پستان ۱۹

۲-۲-۹: درمان سرطان پستان ۲۱

۲-۲-۱۰: سرطان عود کننده پستان ۲۴

۲-۲-۱۱: سرطان پستان در مردان ۲۴

۲-۳: ژنتیک سرطان ۲۵

۲-۳-۱:سرطان ۲۵

۲-۳-۲: انکوژن‌ها ۲۶

۲-۳-۳: ژنهای سرکوب کننده تومور ۲۹

۲-۳-۴: اختلالات تنظیم چرخهی سلولی در سرطان ۲۹

۲-۳-۵: P53 محافظ ژنوم ۳۱

۲-۳-۶: نقش BRCA1/2 31

2-3-7: نقص در ماشین ترمیم ۳۲

۲-۳-۸: توانایی تحریک رگزایی و متاستاز تومورهای بدخیم ۳۲

۲-۳-۹: بررسی مارکرها در خون افراد مبتلا به سرطان پستان ۳۲

۲-۴: آنتی ژنهای سرطانی- بیضه ایی ۳۳

۲-۴-۱: کلاسه بندی ژنهای سرطانی-بیضه ای ۳۴

۲-۴-۲:تنظیم بیان آنتی ژنهای سرطانی – بیضه ایی ۳۵

۲-۴-۳: عملکرد ژنهای سرطانی-بیضه ای ۳۵

۲-۴-۴: ایمونوژنیسیته آنتی ژنهای سرطانی- بیضه ایی ۳۵

۲-۴-۵: ژنهای مورد بررسی: ARMC3, TPTE, TTK 36

2-5: مبانی تئوریک در  Real-Time PCR 38

2-5-1. کنترل داخلی : ۳۹

فصل سوم: مواد و روش ها ۴۱

۳-۱: نمونه گیری ۴۲

۳-۱-۱ .روش جمع آوری و تعداد نمونه ها ۴۲

۳-۲٫استخراج RNA از نمونه بافتهای جمع آوری شده ۴۳

۳-۲-۱ . محلول های مورد نیاز ۴۳

۳-۲-۲٫ روش استخراج RNA از بافت ۴۳

۳-۲-۳ .روش الکتروفورز کردن نمونه  RNAبر روی ژل آگارز ۸/۰ درصد ۴۵

۳-۲-۴٫ ظهور باندهای  RNAبر روی ژل ۴۵

۳-۳٫ تیمار RNA  جهت حذف DNA ژنومی ۴۵

۳-۴ .سنتز cDNA از RNA استخراج شده از بافت ۴۶

۳-۵٫ طراحی پرایمر و پروب و بررسی کیفیت آنها : ۴۶

۳-۵-۱٫ غلظت بهینه پرایمر ۴۷

۳-۵-۲٫ آنالیز منحنی ذوب: ۴۸

۳-۵-۳٫ غلظت بهینه پروب: ۴۸

۳-۵-۴٫ تهیه سریال رقت به منظور بررسی کارائی پرایمرها : ۴۸

۳-۶-. انجام تکنیک Real-Time PCR بر روی نمونه های مورد مطالعه : ۴۸

۳-۶-۱٫ تجزیه و تحلیل نتایج بدست آمده از  Real-Time PCR: 50

3-7. نحوه تجزیه و تحلیل داده ها: ۵۱

فصل چهارم: نتایج و یافته ها ۵۲

۴-۱٫ اطلاعات دموگرافیک جمعیت مورد مطالعه ۵۳

۴-۲ :آنالیز RNA 54

4-2-1 :آنالیز کمی RNA 54

4-2-2 :آنالیز کیفی RNA 54

4-3. آنالیز کمی  RNA تیمار شده ۵۵

۴-۴٫ بهینه سازی پرایمرها ۵۶

۴-۴-۱٫ آنالیز منحنی ذوب: ۵۸

۴-۴-۲٫تعیین غلظت مناسب پروب: ۵۹

۴-۵٫ نتایج Real-Time PCR 60

4-5-1. آمار توصیفی: ۶۰

۴-۶٫ درصد بیان ژن ARMC3 63

4-7. درصد بیان ژن TPTE 65

4-8. درصد بیان ژن TTK 67

4-9. بررسی درصد بیان همزمان ژن‌های سرطانی- بیضه‌ایی ۶۹

فصل پنجم:    بحث، نتیجه گیری    و پیشنهادها ۷۰

پیشنهادات ۷۴

Abstract: 76

References: 77

 

 

فهرست جداول

 

جدول۳-۲: دستورالعمل انجام واکنش بر اساس کیت سازنده ۴۹

جدول۳-۳ :جدول برنامه زمانی Real-timePCR 49

جدول ۴-۱٫ خلاصه ای از اطلاعات دموگرافیک. ۵۳

جدول ۴-۲ :نتایج اندازه گیری غلظت RNA در چند نمونه مجاور تومور و تومور ۵۴

جدول ۴-۳ . نتایج غلظت  RNA تیمار شده در چند نمونه تومور و مجاور تومور ۵۵

جدول۴-۴: توالی پرایمر و پروب استفاده شده در روش Real-Time PCR 56

جدول۴-۵ : چرخه های آستانه برای ژنها با غلظت های مختلف پرایمر ۵۷

جدول ۴-۶: غلظت های بهینه پرایمر و پروب ها ۵۸

جدول۴-۷: آمار توصیفی چرخه های آستانه. ۶۰

جدول۴-۸: درصد بیان ARMC3 در نمونه های نرمال، تومور و مجاور تومور. ۶۳

جدول۴-۹: درصد تغییرات بیان ARMC3 در نمونه تومور نسبت به مجاور ۶۳

جدول۴-۱۰: میانگین ct در بیان ARMC3 در گروههای مختلف بیانی. ۶۴

جدول۴-۱۱ :تفاوت  بیان ARMC3 در سه گروه افزایش، کاهش و عدم تغییر. ۶۴

جدول۴-۱۲: درصد بیان TPTE در نمونه های نرمال، تومور و مجاور تومور. ۶۵

جدول۴-۱۳: درصد تغییرات بیان TPTE در نمونه تومور نسبت به مجاور ۶۵

جدول۴-۱۴: میانگین ct در بیان TPTE در گروههای مختلف بیانی. ۶۶

جدول۴-۱۵: تفاوت  بیان TPTE در سه گروه افزایش، کاهش و عدم تغییر بیان. ۶۶

جدول۴-۱۶: درصد بیان TTK در نمونه های نرمال، تومور و مجاور تومور. ۶۷

جدول ۴-۱۷: درصد تغییرات بیان TTK در نمونه تومور نسبت به مجاور ۶۷

جدول۴-۱۸٫ میانگین ct در بیان TTK در گروههای مختلف بیانی. T 68

جدول۴-۱۹: تفاوت  بیان TTK در سه گروه افزایش، کاهش و عدم تغییر بیان. ۶۸

جدول۴-۲۰: بررسی درصد بیان همزمان ژن‌های سرطانی- بیضه‌ایی در نمونه‌های توموری ۶۹

 

 

 

فهرست اشکال

شکل ۱-۱: شماتیکی از ساختار میکروسکوپی پستان ۸

شکل۱-۲: ARMC3  دارای ۱۹ اگزون می باشد ۳۷

شکل ۳-۱٫ نمایی از برنامه دمایی دستگاه مورد استفاده ۵۰

شکل ۴-۱٫ ظهور باندهای۱۸S و ۲۸SRNA ریبوزومی حاصل از الکتروفورز نمونه های RNA بر ژل اگارز ۸/۰% ۵۵

شکل۴-۲٫ نتایج اولیه بهینه سازی پرایمرها. ۵۷

شکل۴-۳: منحنی ذوب سمت راست ARMC3 وسط TPTE سمت چپ TTK 58

شکل ۴-۴٫ نتیجه انجام الکتروفورز بر روی محصولات PCR. 59

شکل ۴-۵٫ نمایی از Amplification Plot  ژنهای مورد بررسی. ۶۲

 

12000 تومان – خرید